الكشف عن المواد المعدلة وراثيا

الكشف عن المواد المعدلة وراثيا باستخدام تقانات البيولوجيا الجزيئية لبعض المنتجات الموجودة في الأسواق المحلية

الطالبة نور غازي الأسعد

الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية- قسم التقانات الحيوية
الجهة المانحة للشهادة: جامعة دمشق- كلية الزراعة- 2010

بلغت المساحات المزروعة بالمحاصيل المعدلة وراثياً (125) مليون هكتار في عام 2008 تزرع من قبل 13.3 مليون مزارع في 25 دولة. وشمل التعديل الوراثي العديد من المحاصيل أهمها فول الصويا الذي زرع على مساحة 65.8 مليون هكتار بما يعادل 52% من المساحة العالمية للمحاصيل المعدلة, يليه الذرة على مساحة 37.3 مليون هكتار بما يعادل 24% ثم القطن بنسبة 12.3%, ثم اللفت الزيتي(الكانولا) بنسبة 4.7%. تشمل أهم أغراض التعديل الوراثي مقاومة الحشرات وزيادة تحمل مبيدات الأعشاب، بالإضافة لتحسين الجودة و القيمة الغذائية وغير ذلك (James 2009). يتم التعديل الوراثي عادة من خلال نقل المورث المانح للصفة المرغوبة, والذي يكون موجود ضمن تركيب البلازميد ( (constructالذي يتألف عموماً من الأجزاء التالية التي تعمل مجتمعة على إعطاء الصفة المرغوبة:

http://www.gcsar.gov.sy/gcsarAR/loca..._rtl-df008.gif المحفز (Promoter) لعمل المورث، ويعد المحفز المأخوذ من Cauliflower mosaic virus (P-35S) أكثر استخداما" لعملية التعديل الوراثي لأنه يعمل وبشكل دائم وجيد مع معظم المورثات .

http://www.gcsar.gov.sy/gcsarAR/loca..._rtl-df008.gif المنهي أو (Terminator) الذي يوقف عملية نسخ المورث، ومن أشهرها (T-Nos) (Nopaline synthase)) (Weijdeven 2003)

http://www.gcsar.gov.sy/gcsarAR/loca..._rtl-df008.gif المورث المانح للصفة المرغوبة (المنطقة المشفرة): حيث تم استخدام العديد من المورثات لمنح العديد من الصفات المرغوبة وأشهرها مورث مقاومة الحشرات حرشفية الأجنحة في نبات الذرة CRYIA(b) gene و (Chowdhury et al., 2003) CRYIA(c) gene, أو مورث مقاومة المبيدات العشبية في نبات فول الصويا EPSPS gene (Vaïtilingom et al., 1999)

http://www.gcsar.gov.sy/gcsarAR/loca..._rtl-df008.gif المورثات التي تعمل كمؤشرات انتخابية للتمييز بين النباتات المعدلة وغير المعدلة خلال عملية التعديل مثل مورث مقاومة الكاناميسين kanamycine (nptII) والمورث المسؤولة عن مقاومة المبيدات العشبية phosphinotricin acetyltransferase (bar gene) (Vaïtilingom et al., 1999).
ومازال الجدل مستمرا" حول سلامة مثل هذه المواد، مما يوجب على البلدان النامية الموازنة بين اهتماماتها التجارية ومسؤوليتها لتحسين كمية ونوعية المنتجات الزراعية والغذائية وتوفيرها للناس إضافة إلى التزامها بحفظ وصيانة التنوع الحيوي.
توافق بعض الدول على استيراد النباتات المعدلة وراثيا" بصور مختلفة سواء كبذور للزراعة أو بشكل مصنع كالزيوت. وبعض الدول لا تسمح بدخول هذه المنتجات، حيث أن هناك تشريعات وقرارات في العديد من البلدان تنص على ضرورة الكشف عن المواد المعدلة وراثياً وأن تكون النسبة المئوية للتعديل الوراثي أحد مكونات الملصق الغذائي. ففي السوق الأوروبية المشتركة مثلا"، يجب إعلام المستهلك إذا احتوت المادة الغذائية على مواد معدلة وراثيا" بنسبة 1% أو أكثر .(Querci et al. 2000)
توجد العديد من الطرائق المتبعة للكشف عن المواد المعدلة وراثياً والتي يمكن من خلالها الكشف عن وجود هذه المواد أو كشف وتحديد هوية المادة المعدلة وراثياً وكميتها منها تقنية سلسلة تفاعل البوليميراز ( Polymerase Chain Reaction, PCR) التي استخدمت في مجالات متعددة للكشف عن وجود كميات قليلة من الـDNA وبدرجة عالية من التخصص وذلك في العديد من الأغذية المعدلة وراثيا" كالبندورة وفول الصويا (Ming,2002) والذرة ( (Lih et al.,2002وغير ذلك من المحاصيل. وعموما" يمكن أن نميز بين نوعين مختلفين من الـPCR خلال الكشف عن المواد المعدلة وراثياً، فمنها طرائق غير متخصصة تهدف للكشف عن المقاطع الوراثية المستخدمة بشكل واسع في معظم عمليات التعديل مثل الـP-35S و T-NOS, والطرائق الأخرى أكثر تخصصاً, تقوم بالكشف عن مورثات معينة تكون أحيانا خاصة بالنوع النباتي وتعطي الصفة المرغوبة .(Ahmed,1999)
وعموماً، في سورية، هناك اهتمام ووعي شعبي كبير ومتزايد لحماية وحفظ التنوع الحيوي من الإدخال العشوائي غير المدروس وغير القانوني للمواد المعدلة وراثياً. لذلك، يعتبر الإدخال المنظم والمدروس للمواد المعدلة وراثياً من الأولويات، وبالتالي فان القانون الذي ينظم مثل هذا الإدخال والتداول لهذه المواد يعتبر أمراً ملحاُ بغية تنظيم وحماية التنوع الحيوي الوافر في سورية، ناهيك عن الأسباب الاقتصادية والاجتماعية المترتبة على ذلك.
يهدف هذا البحث إلى اختبار بعض المحاصيل والمنتجات الموجودة في الأسواق المحلية للكشف عن وجود تعديل وراثي فيها.

لتنفيذ هذا البحث جمعت عينات من مصادر مختلفة شملت مواد مستوردة وأخرى محلية من مواد متنوعة:
1- مواد علفية ( كسبة الصويا و الذرة و الشعير) التي تستخدم بشكل أساسي في خلطات علائق الحيوانات.
2- مواد غذائية طازجة تستهلك مباشرة (بندورة، خيار).
3- مواد أولية للتصنيع شملت بذور فول الصويا، بذور عباد الشمس، بذور ذرة البوشار, الرز والتي ستخضع لعمليات تصنيعية مثل تصنيع الزيوت النباتية ومنتجاتها الثانوية العلفية (الكسبة).
كما تم استخدام بلازميدات مختلفة كشاهد إيجابي لوجود بعض المورثات خلال الكشف عنها, منها PGIIMH35-2PS, TOP10 PGII35S CRYA(b), TOP10 PGII35S CRYA(c), pBI-221
ثم تم استخلاص الـ DNA من العينات المدروسة وفق طرق مختلفة حسب نوع العينة المدروسة كالتالي:
1- استخلاص الـDNA من العينات البذرية (فول الصويا– كسبة فول الصويا- الذرة- الشعير- ذرة البوشار) باستخدام طريقة CTAB حسب (Querci and Mazzara.2001).
2- استخلاص الـ DNA من العينات الورقية (بندورة-خيار-عباد الشمس) وفق طريقة Doyle and Doyle 1990) المعدلة.
3- استخلاص الـDNA من البلاسميدات المستخدمة كشاهد إيجابي: تم استخلاص البلاسميدات من البكتريا المعدلة وراثيا" EHA105 Agrobacterium t. النامية على الوسط السائل LB مع إضافة μ1 من المضاد الحيوي كاناميسين بتركيز 50ملغ/ليتر وفق طريقة Alkaline lysis حسب(Sambrook and Russell, 2001).
ثم تم قياس تركيز الـDNA (الدنا) في العينات باستخدام المطياف الضوئي (السبيكتروفوتوميتر)، كما حسبت النسبة المعبرة عن نقاوة الدنا المستخلص والتي تراوحت بين 1.5 و 1.8 للعينات المدروسة مما يدل على نوعية جيدة للـ DNA, وبناء على قيمة التراكيز تم تخفيف عينات الـ DNA للحصول على تركيز نهائي قدره ng/ μl 50 وهو التركيز المطلوب في تفاعل ال PCR الذي أجري باستخدام جهاز التفاعل التسلسلي للبوليميراز PCR من نوع Mastercycler-Eppendorf بحجم تفاعل كلي lµ 25 يحوي 100 ng من الـ DNA في وسط يحوي من المحلول الواقي 1X, ,2 mM MgCl 0.4 Pmol, 0.32 mM dNTPs من كل بادئة , وبوجود 0.5 وحدة أنزيمية حيث أن دورات جهاز الـPCR خلال التفاعل كانت بداية لفك الالتحام بين سلسلتي الدنا على حرارة 94 م° لمدة 5 دقائق تتبع بـ 94 م° لمدة دقيقة ثم حرارة الالتحام الملائمة لكل بادئ لمدة دقيقة واحدة تتبع بحرارة 72م° لمدة دقيقة وتكرر الخطوات الثلاثة السابقة 35 دورة، ثم على حرارة 72م° لمدة 5 دقائق لدورة واحدة وتحفظ إلى اللانهاية على حرارة 4م° إلى حين الاستخدام.
وقد استخدم 13 بادئاً متخصصاً بالأجزاء الأكثر استخداماً في عمليات التعديل الوراثي مثل المحفز Cauliflower mosaic virus (P-35S) والمحدد (T-Nos) Nopaline synthase ومورث مقاومة المبيد العشبي غليفوسات (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS ومورث مقاومة الحشرات حرشفية الأجنحة CRYIA(c) , CRYIA(b) ومورث مقاومة الكاناميسين kanamycine (nptII) والمورث المسؤول عن مقاومة المبيدات العشبية phosphinotricin acetyltransferase (bar gene) كذلك مورث الإنتخاب GUS GENE كما تم إجراء اختبارات للتأكد من النقاوة وعدم الخلط لعينات الـDNA المعزولة باستخدام بادئات خاصة بالمورثات المستهدفة، مثل اختبار الكشف عن مورث اللكتين في فول الصويا ومورث الـzein في الذرة.
وبينت النتائج وجود مواد معدلة وراثياً في5 من أصل 6 عينات كسبة فول الصويا المستوردة شملت المحفز 35S والمنهي Nos والمورث EPSPS كما بينت أن 3 من أصل 16 عينة ذرة مستوردة تحتوي على المحفز 35S والمنهي Nos، بينما كانت النتيجة سلبية في كل العينات الأخرى المختبرة بالنسبة لوجود المورثات التي تم التحري عنها. مع العلم أنه تم التأكد من النتائج السابقة بثلاث طرق:
الأولى تعتمد على استخدام بلازميدات خاصة بكل مورث أو مقطع أعطت قطعة الـDNA عند نفس الوزن الجزيئي الظاهر عند العينة المعدلة وراثياً, وذلك بعد إجراء تفاعل الـPCR وفي حال عدم توفر البلازميد المحتوي على المورث المدروس, تقارن النتيجة الظاهرة مع نتائج لدراسات سابقة استخدم فيها نفس البادئ وظهر فيها نفس الوزن الجزيئي لقطعة الDNA المكاثرة بالـ PCR.
الثانية اعتمدت على استخدام المعلوماتية الحيوية للحصول على كامل التسلسل النكليوتيدي للمورث المدروس لحساب حجم لقطعة الDNA المكاثرة بالـ PCR.
أما الطريقة الثالثة فكانت باستخدام تقنية Nested PCR .
كما تم استخدام تقنية multiplex PCR حيث يتم اجراء الكشف عن نوعين من المورثات في نفس تفاعل ال PCR باستخدام بادئين متخصصين في نفس التفاعل.
وهكذا تظهر الدراسة الحالية إمكانية الكشف عن المواد المعدلة وراثياً محلياً، كما تظهر وجود بعض العينات المعدلة وراثياً في الأسواق المحلية وذلك في العينات المدروسة المستوردة حصراً، وخلو العينات المحلية من أي من المورثات المدخلة التي تمت دراستها وذلك باستخدام تقنية ال PCR, Multiplex PCR, and Nested PCR.
نستنتج من الدراسة الحالية بأن عملية مراقبة دخول النباتات المعدلة وراثياً إلى القطر يتطلب عملية تطوير علمي وتقني للبنى التحتية لتكون قادرة على كشف وجود النباتات المعدلة وراثياً وتحديد نسبتها في العينات المختبرة لمعرفة مدى توافقها وانسجامها مع القوانين والأنظمة والتشريعات الموجودة في القطر التي تحكم و تنظم هذه العملية، ولهذا تعد الدراسة الحالية لبنة أساسية لبناء القدرات في مجال الكشف عن المواد المعدلة وراثياً بغية تطبيق القوانين والتشريعات الناظمة ذات العلاقة وخاصة قانون الأمان الحيوي الذي هو قيد الدراسة من أجل حماية التنوع الحيوي في سوريا ومراقبة المنتجات المستوردة والتأكد من أنها غير معدلة وراثياً والحفاظ على صحة الإنسان والبيئة من الآثار المحتملة للكائنات المعدلة وراثياً